服務介紹

RNA免疫沉淀（RIP）利用針對目標蛋白質的抗體把相應的RNA-蛋白質復合物沉淀下來，經過分離純化并對結合在復合物上的RNA進行測序或qPCR分析。RIP可應用于研究miRNA調節靶點、RNA與RBP（RNA結合蛋白）的互作關系等。

RIP技術原理

技術優勢

1. 核酸和蛋白實驗兼做，結果可靠；

2. 自主研發RIP試劑盒，暢銷國內市場，效果有保證。

客戶提供

1. 新鮮細胞/組織樣本（組織≥100mg，細胞不少于1E+7個），細胞須保證無支原體污染；

2. IP級別抗體和抗體信息；

3. qPCR檢測基因信息：物種、基因名稱、長度和序列等，指定具體轉錄本（例如NCBI編號NM_001126113.2）；

4. RIP產物的其他檢測項目（RIP-seq或者IP蛋白樣本質譜）。

我們提供

1. RIP實驗報告（方法、流程，結果）；

2. RIP剩余產物。

案例1

參考文獻：

Bai D, Zhao J, Wang R, Du J, Zhou C, Gu C, Wang Y, Zhang L, Zhao Y, Lu N. Eubacterium coprostanoligenes alleviates chemotherapy-induced intestinal mucositis by enhancing intestinal mucus barrier. Acta Pharm Sin B. 2024 Apr;14(4):1677-1692. doi: 10.1016/j.apsb.2023.12.015. Epub 2023 Dec 30. PMID: 38572095; PMCID: PMC10985029.

案例2

參考文獻：

Xu L, Ma X, Zhang X, Zhang C, Zhang Y, Gong S, Wu N, Zhang P, Feng X, Guo J, Zhao M, Ren Z, Zhang P. hsa_circ_0007919 induces LIG1 transcription by binding to FOXA1/TET1 to enhance the DNA damage response and promote gemcitabine resistance in pancreatic ductal adenocarcinoma. Mol Cancer. 2023 Dec 4;22(1):195. doi: 10.1186/s12943-023-01887-8. Erratum in: Mol Cancer. 2024 Jan 16;23(1):16. PMID: 38044421; PMCID: PMC10694898.

以anti-SNRNP70為目的抗體，anti-IgG為對照抗體，在Hela細胞裂解樣本中，進行免疫沉淀。免疫沉淀所得蛋白質樣品，進行Western blot檢測，Input樣本與目的樣本在約70KDa大小位置有明顯條帶，陰性對照樣本無條帶。

免疫沉淀所得RNA逆轉成cDNA后，以U1 snRNA特異性引物，進行qPCR分析，RIP組相對表達顯著高于IgG組，指示SNRNP70富集U1 snRNA。

Western blot檢測SNRNP70：

qPCR檢測U1 snRNA：

1. RIP送樣里細胞需要量是1E7的細胞量，是必須要達到1?10的7次方的細胞量嗎？

我們推薦用7次方進行，這種內源結合本來就只能結合少量的蛋白和RNA，如果最開始的細胞量少，結合下來的物質可能會更少。

2.RIP實驗產物能否進行去線性，進行circRNA建庫？

如果客戶RIP捕獲前已經打斷了RNA，這直接可以判斷，不能去線性

如果捕獲產物中RNA的片段化程度比較高，不建議用去線性的方法測circRNA。

一般RIP測序，都是建議用去rRNA鏈特異的方面進行建庫測序。

3.RIP結果WB檢測正常，Input、IP、Igg三組ct值幾乎無差異說明什么？

說明目的蛋白與檢測基因無特異性結合。

4.為什么RIP實驗前要做WB預實驗評估？

做WB預實驗主要目的：

①　檢測抗體的特異性，是否能結合目的蛋白；

②　檢測樣本中目的蛋白是否有表達及豐度水平；

③　總之，檢測該樣本能否滿足做RIP實驗的最基本條件。

④　RIP預實驗做的是WB檢測，跟我們平常理解的預實驗不太一樣，這是探索性實驗，預實驗的目的是檢測這個實驗的基本條件。

5. 我的抗體做WB都有目的蛋白條帶的，為啥做RIP就沒條帶了？

免疫試驗有很多，但實驗目的不一樣，例如WB、ELISA、IP、IF、ChIP、IHC(P)、FACS，其中只有WB是一種需要將蛋白質變性的實驗，用強烈的蛋白變性劑SDS和β巰基乙醇，將蛋白質的三維結構全部抹去，這種情況下任何一種該蛋白的抗體都能識別WB實驗中變成直線狀態的抗原；但能做WB的抗體就不一定能用來做非變性試驗IP、IF、IHC了，因為天然蛋白的三維結構隱藏了很多抗體結合位點，WB級別的抗體無法與之結合。做RIP實驗，需要選購IP級別的抗體。

6. 在RIP實驗中，為什么IP和WB使用的抗體需要來源于不同的種屬？

在RIP實驗中，IP和WB使用的抗體需要來源于不同的種屬，否者在跑WB時，會在55KD和25KD的位置出現較強的重鏈和輕鏈，影響目的蛋白的曝光。