服務(wù)介紹

利用隨機(jī)引物對(duì)富集后的circRNA進(jìn)行滾環(huán)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，采用納米孔測(cè)序技術(shù)對(duì)circRNA的全長(zhǎng)序列進(jìn)行直接測(cè)序，并使用特定算法，實(shí)現(xiàn)對(duì)長(zhǎng)測(cè)序片段中的circRNA序列進(jìn)行識(shí)別和全長(zhǎng)重構(gòu)。

圖1：circRNA全長(zhǎng)納米孔測(cè)序技術(shù)路線

測(cè)序方案

測(cè)序模式：Nanopore sequencing

測(cè)序數(shù)據(jù)量：1 Gb raw data

納米孔測(cè)序技術(shù)在檢測(cè)circRNA上的優(yōu)勢(shì)：

1.更強(qiáng)的檢出率：相比二代測(cè)序，納米孔測(cè)序可以?將circRNA reads檢測(cè)效率提高20倍以上。

2.更高的靈敏度：可識(shí)別低豐度的circRNA，能夠更敏感地捕獲到非經(jīng)典circRNA，i.e., intronic。

3.更多更準(zhǔn)確的應(yīng)用領(lǐng)域：

1）準(zhǔn)確識(shí)別可變剪切事件，無(wú)需拼接，一鍵生成；

2）直接識(shí)別癌癥等重大疾病發(fā)生發(fā)展的重要生物標(biāo)志物一一融合環(huán)狀RNA(f-circRNA)；

3）能夠更敏感的識(shí)別研究熱點(diǎn)一一線粒體環(huán)狀RNA，確保您的研究不會(huì)落空。

基于三代測(cè)序技術(shù)分析circRNA全長(zhǎng)

Comprehensive profiling of circular RNAs with nanopore sequencing and CIRI-long. Zhang J et al. Nature biotechnology, 2021. (IF: 36.558)

測(cè)序策略：circRNA Nanopore sequencing

研究樣本：小鼠腦組織

本研究開發(fā)了一種高效測(cè)定circRNA全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的實(shí)驗(yàn)和計(jì)算方法：利用隨機(jī)引物對(duì)circRNA進(jìn)行的滾環(huán)反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增后，使用納米孔測(cè)序技術(shù)對(duì)circRNA的全長(zhǎng)序列進(jìn)行直接測(cè)序，并開發(fā)了CIRI-long 算法，實(shí)現(xiàn)對(duì)長(zhǎng)測(cè)序讀段中的circRNA序列進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別和全長(zhǎng)重構(gòu)。

作者發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的納米孔測(cè)序體系能夠在總Reads中測(cè)到6%的circRNA信息，而在傳統(tǒng)的PE150二代測(cè)序數(shù)據(jù)中，總RNA測(cè)序結(jié)果中只有0.06%的Reads是circRNA數(shù)據(jù)，RNase R處理也只能得到0.27% 的circRNA數(shù)據(jù)。相對(duì)于二代測(cè)序，納米孔三代測(cè)序結(jié)合CIRI-long分析方法可以將檢測(cè)效率提高20多倍。并且，納米孔三代測(cè)序能夠?qū)崿F(xiàn)<100bp~5kb長(zhǎng)度circRNA的全序列組裝，而二代測(cè)序（PE150）僅能拼接300bp以內(nèi)的序列。比較對(duì)照的二代測(cè)序數(shù)據(jù)以及CircAtlas數(shù)據(jù)庫(kù)信息，本文的體系得到了更多circRNA信息。納米孔測(cè)序得到了一半多的全新circRNA，但這些circRNA的豐度較低，說(shuō)明納米孔測(cè)序體系具有更高的靈敏度，可以檢測(cè)到更多的circRNA分子（圖1）。兩次生物學(xué)重復(fù)的樣品能很好地吻合，說(shuō)明該體系具有較高的穩(wěn)定性（圖2）。

Figure 1. 納米孔測(cè)序體系具有更強(qiáng)的檢出率

Figure 2. 納米孔測(cè)序體系具有較高的穩(wěn)定性

 circRNA可變剪切是多樣性的重要體現(xiàn)，作者從這批納米孔測(cè)序數(shù)據(jù)中分析了circRNA可變剪切的情況，在15905個(gè)基因來(lái)源的circRNA中共分析到115755種可變剪切分子。而二代測(cè)序的數(shù)據(jù)中只從6928個(gè)基因中分析到了25159種可變剪切分子。四種類型的可變剪切都存在，總體而言，在納米孔測(cè)序的數(shù)據(jù)中分析得到的可變剪切數(shù)目均高于二代測(cè)序的數(shù)據(jù)（圖3）。作者還發(fā)現(xiàn)了內(nèi)含子自動(dòng)形成的circRNA（圖4）。

Figure 3. CIRI-long分析circRNA和剪切多樣性

Figure 4.內(nèi)含子自剪切形成的circRNA

生物信息分析

基礎(chǔ)分析

原始數(shù)據(jù)質(zhì)控檢查

比對(duì)結(jié)果質(zhì)控檢查

樣品表達(dá)質(zhì)控

基于circRNA表達(dá)的樣品主成分分析

circRNA全長(zhǎng)鑒定

circRNA在染色體上的分布特征分析

circRNA長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)與分析

circRNA可變剪切isoform識(shí)別

高級(jí)分析

circRNA差異分析

差異circRNA宿主基因的GO功能分析

差異circRNA宿主基因的KEGG通路富集分析

差異circRNA宿主基因的Reactome通路富集分析

差異circRNA的靶向miRNA預(yù)測(cè)分析

circRNA及靶向miRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖

circRNA-RBP 關(guān)系預(yù)測(cè)

circRNA 翻譯潛能預(yù)測(cè)

個(gè)性化分析

融合基因來(lái)源的f-circRNA識(shí)別融合基因來(lái)源的f-circRNA

部分結(jié)果示例

圖1：circRNA全長(zhǎng)納米孔測(cè)序鑒定隱藏且復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄與可變剪切圖譜

圖2：mmu-circMsrb3 0004在小鼠心臟/腦中的表達(dá)水平

小鼠基因Msrb3只包含3個(gè)線性轉(zhuǎn)錄本，卻能夠轉(zhuǎn)錄至少10個(gè)環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本分子（如圖1）。circRNA全長(zhǎng)納米孔測(cè)序鑒定出的circRNAs多種多樣，包括exonic circRNAs、ElciRNAs、intronic circRNAs，相比lllumina僅僅檢測(cè)BSJ，Nanopore全長(zhǎng)鑒定能夠觀察到circRNA真實(shí)的內(nèi)部構(gòu)造，甚至發(fā)現(xiàn)新的circRNA外顯子（如圖1中紅色框）。

特別地，Nanopore以及l(fā)llumina都檢測(cè)到mmu-circMsrb3_0004在小鼠心臟/腦中有較高的表達(dá)（如圖2），circRNA全長(zhǎng)納米孔測(cè)序更是識(shí)別到該環(huán)狀分子的3個(gè)isoforms。

圖3：Nanopore與lllumina測(cè)序circRNA豐度比較

圖4：circRNA全長(zhǎng)納米孔測(cè)序檢測(cè)到6號(hào)染色體的基因SCAF8的外顯子3-4與QKI的外顯子5發(fā)生了融合，并形成了環(huán)狀RNA分子。

圖5：circRNA全長(zhǎng)納米孔測(cè)序在人類前列腺癌細(xì)胞中檢測(cè)到了大量線粒體環(huán)狀RNA，這些分子主要分布于輕鏈。

Table.ONT circRNA full-length Seq原始樣本送樣建議

Table.ONT circRNA full-length Seq RNA樣本送樣建議

*更具體的送樣方法請(qǐng)?jiān)斣冧N售或技術(shù)支持

物種范圍：人、小鼠、大鼠等哺乳動(dòng)物，擬南芥、水稻、番茄、玉米、大豆等植物，其他物種詳詢銷售或技術(shù)支持